Hvorfor brukes western blot til å bekrefte elisa? + Eksempel

Hvorfor brukes western blot til å bekrefte elisa? + Eksempel
Anonim

Svar:

Vanligvis er dette en antistoff-spesifisitetstest.

Forklaring:

I en ELISA er det svært vanskelig å fortelle om antistoffet ditt er bindende for proteinet av interesse, et helt annet protein eller en rekke proteiner.

Western blottet vil bli brukt til å kontrollere antistoffets spesifisitet (du bør merke at Western blott ikke kan oppdage alle kryssreaksjoner med feil proteiner).

I Western blot kan du se størrelsen på proteinet som antistoffet er bindende til (du kan ikke i en ELISA). Hvis for eksempel antistoffet ditt burde være bindende til et protein på 56 kDa og du ser et bånd på ~ 56 kDa på blottet, kan du derfor være rimelig trygg på at antistoffet er bindende til riktig protein.

Hvis du derimot så et bånd på 32 kDa, kan du konkludere med at antistoffet er bindende til feil protein. På samme måte, hvis mange band dukket opp på Western blot, ville det foreslå (i fravær av proteindegradering) at antistoffet var bindende til et utvalg av forskjellige proteiner.

I eksemplet på 32 kDa båndet som vises på gelen, og også multibåndene, vil det foreslå at antistoffet mangler spesifisitet for ELISA, og at eventuelle resultater sett i ELISA, ikke kan være spesifikke for proteinet av interesse.

Hvis jeg kjørte denne typen test, kan jeg inkludere en slags "forstyrrende" reagens for å teste antistoffet. For eksempel, hvis jeg hadde hevet antistoffet mitt mot et peptid, kan jeg inkludere peptidet i den primære antistoffoppløsningen for å teste for korrekt binding. Det vil si, i nærvær av peptidet, burde jeg ikke se noe bånd eller noe resultat fra ELISA fordi mitt primære antistoff ikke kunne binde på grunn av tilstedeværelsen av et overskudd av peptidet.